Artículo Original publicado en la Revista Médica de la Facultad de Medicina y Cirugía de la UABJO, Vol1, No. 4 Julio/septiembre 2000. Con autorización de los editores: Dr. Alberto P. Ramírez Galván y Aurelio Cortés Peralta.
DIAGNOSTICO MOLECULAR y NEUROPATOLOGIA DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Ignacio Rafael RamÍrez Villegas*, Raúl Mena López**, José Luna***
RESUMEN:
La enfermedad de Alzheimer (EA), es una demencia senil neurodegenerativa que afecta entre el 6 y el 15 por ciento de la población mayor de 65 años. En México, existen unos 350.000 casos. El trabajo describe la neuropatología molecular de la EA y su correlación con las técnicas histopatológicas para el estudio postmortem de muestras de tejido cerebral. La técnica de Bielschowsky aplicada a cortes cerebrales de tres sujetos fallecidos con el diagnóstico clínico de EA, permitió establecer la correlación clínico-patológica de los tres pacientes estudiados en este trabajo.
Palabras Clave:Demencia senil, enfermedad de Alzheimer, Bielschowsky.
SUMMARY:
The illness of Alzheimer (EA), it is an insanity senile neurodegenerativa that affects between the 6 and the population's 15 percent bigger than 65 years. In Mexico, about 350 exist. 000 cases. The work describes the molecular neuropatología of the EA and its correlation with the technical histopatológicas for the study postmortem of samples of cerebral fabric. The technique of Bielschowsky applied to cerebral courts of three fellows deceaseds with the clinical diagnosis of EA, allowed to establish the clinical-pathological correlation of the three patients studied in this work.
Words Key: Senile insanity, illness of Alzheimer, Bielschowsky.
INTRODUCCION:
La enfermedad de Alzheimer recibe ese nombre en honor a la investigación científica que hicera el patólogo alemán Alois Alzheimer en 1907 sobre un tipo de desorden neuropsiquíatrico. Sus investigaciones se basaron en el establecimiento de una correlación entre la sintomatología clínica de pacientes con ese transtorno, y la aparición de estructuras patológicas en el cerebro de esos pacientes mediante técnicas de tinciones argénticas. En su trabajo experimental a principios de este siglo, este investigador observó mediante dichas técnicas en tejido cerebral proveniente de autopsias de tales enfermos, la presencia de marañas neurofibrilares (o tangles). Como se menciona, estas estructuras fueron encontradas en cerebros de pacientes que clínicamente mnifestaron un deterioro gradual en sus funciones cognoscitivas. Sin embargo, estas estructuras no se encontraron en tejido cerebral obtenido postmortem de personas de edad que no presentaron estos síntomas.
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una de las demencias seniles más comunes, representa un transtorno neurodegenerativo que afecta entre el 6 y el 15% de la población mayor de 65 años, sin distingo de país, raza, sexo o estado socioeconómico. Se calcula que en México existen unos 350.000 casos, mientras que en las naciones industrializadas es la cuarta causa más frecuente de muerte. El proceso de degeneración neuropatológico involucra la muerte de células nerviosas y la disminución en los ni- veles de ciertos neurotransmisores. Sin embargo, los mecanismos exactos que llevan a la perdida neuronal aún no han sido dilucidados completamente, y por tanto, no existe hasta el momento ningún tratamiento farmacológico o quirúrgico que haya demostrado satisfactoriamente su eficacia contra la EA. Clínicamente la EA se caracteriza por la perdida gradual e irreversible de la memoria y el deterioro de las funciones cognoscitivas, del lenguaje, el juicio y la conducta. A menudo suele simular una psicosis. Histopatológicamente este mal se asocia a la formación y acumulación gradual de 2 estructuras neuropatológicas básicas: las Marañas Neurofibrilares que se localizan en el interior de la neurona y las Placas Neuríticas compuestas por acumulaciones extracelulares de neuritas distróficas y axones, además de células de la microglía activadas y astrocitos reactivos formando una corona que rodea a un núcleo de polipéptido amiloide BA4. Las marañas neurofibrilares estan formadas por filamentos helicoidales apareados, constituidos principalmente por la proteína tau y cuya presencia provoca serios trastornos en la actividad fisiológica de las neuronas que se traduce en un aislamiento y desconexión de las vías de conectividad neuronal involucradas en las funciones cognoscitivas. En el diagnóstico clínico de la EA es importante tener en cuenta la multitud de factores (la mayoría no modificables) que deberán analizarse como: la edad, factores genéticos, el sexo (es mayor la frecuencia en mujeres), el ambiente y hasta un trauma craneal. En virtud de esta multifactorialidad en su génesis es común dar un diagnóstico clínico erróneo de EA al confundirla con otros procesos demencia les como la enfermedad de Pick. El diagnóstico definitivo de la EA se realiza con el análisis neuropatológico postmortem del tejido cere- bral. En los últimos años, ha sido posible entender mejor la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer gracias al desarrollo de la inmunocitoquímica, el procesamiento y análisis de imágenes, la microscopía confocal, la biología y la genética moleculares. Herramientas que son sumamente valiosas en el diagnóstico microscópico de la Enfermedad de Alzheimer. En este trabajo se describirán brevemente la neuropatología molecular de la EA y las técnicas ocupadas en el estudio postmortem de varias muestras de tejido cerebral.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se utilizaron fragmentos de lóbulo frontal medio, lóbulo parietal inferior e hipocampo de 3 cerebros distintos correspondientes a igual número de personas que en vida fueron clínicamente diagnosticadas con la enfermedad de Alzheimer y que aceptaron donar su encéfalo al fallecer para fines de investigación científica. De estas personas, 2 fueron mujeres. La edad del fallecimiento iba de los 74 a los 81 años de edad mientras que la edad en la que aparecieron los síntomas fluctuó entre los 68 y los 73 años. Todos eran mexicanos y fallecieron en el transcurso de 1998. Por razones éticas se omiten demás datos personales.
Es importante señalar que 2 personas contaban con antecedentes familiares de demencia senil, mientras que otro no, ninguno tenía más antecedentes psiquiátricos. Cada cerebro se clasificó de acuerdo a la fecha de fallecimiento como 02-98, 03-98 Y 04-98 respectivamente, este último correspondiente a una persona del sexo masculino. Todos se conservaron en un cuarto especial de refrigeración sumergidos en una solución de paraformaldehido a1 4% en solución buffer-fosfato (PBS) simple.
De cada cerebro y de cada región mencionada se obtuvieron 60 cortes histológicos, la mitad mediante micrótomo convencional (51-1 de grosor) y el resto por micrótomo crióstato (501-1 de espesor). Cortes totales: 540.
Se dividieron en 4 grupos iguales de 135 cada uno y se prepararon mediante la técnica de Bielschowsky, inmunocitoquímica, inmunofluorescencia e inmunocitoquímica (para microscopía confocal), respectivamente. La técnica de Bielschowsky es útil para vislumbrar marañas y placas. Básicamente consiste en pasar los cortes por una solución de Nitrato de Plata al 20% en la oscuridad, lavarlas y volverlas a pasar por una solución de plata amoniacal, lavarlas en agua amoniacal, agua destilada y finalmente fijarlas en tiosulfato de sodio.
Las técnicas de inmunofluorescencia e inmunocitoquímica siguen procedimientos similares entre si, en la primera se bloquean fluores con albúmina libre de IgG y en la segunda se bloquea la HRP con peroxidasa endógena antes de ponerse en contacto con el anticuerpo primario monoclonal, que en el primer caso corresponde a anticuerpo s alfa-423 y alfa-AD2 utilizados en diluciones 1:100 y 1:400 marcando especificamente contra la proteína tau y la glía anormal, y en el segundo caso además se utilizan los anticuerpo s Glu-391 y Mo IgG cultivado de ratón, dejándose en oscuridad y a 4 grados centigrados toda una noche.
Al día siguiente se lavan con PBS tritón (PBSt) al 0.2% para ponerse en contacto con el anticuerpo secundario que corresponde a alfa-Mo IgG FITC y alfa-Rb IgG más CY5 en el primer caso y alfa-Mo IgG HRP respectivamente dejándolos una hora a temperatura ambiente. Posteriormente los cortes se lavarán nuevamente con PBSt y en la inmunofluorescencia se marcan los filamentos con rojo tiazina, se lava y una vez fijado el corte esta listo para observarse. En la inmunocitoquímica, el proceso se continuó con DAB (0.006 gil O mI de PBSt) lavándola con H2O2 al 30% e inactivando con Cl-, esto "pintó" de café a las marañas dejando el corte en condiciones de ser fijado y observado; hicimos además un doble marcado contra placas y marañas repitiendo el proceso con otros cortes y lo continuamos tiñendo con violeta de cresilo, lavándolo y deshidratándolo con R-OH al 70, 80, 90 Y 100% respectivamente. Finalmente se lavó en xilol, se montó en DPX y estuvo listo para observarse. Para usar el microscopio confocal es necesario preparar los cortes de inmunofluorescencia guardándolos previamente en refrigeración. La microscopía confocal prepara una serie de imágenes mediante una serie de "scannings" con un láser, que hace las veces de un micrótomo óptico (en el sentido de que no hay un corte material sino óptico), la imagen se separa en tres canales: rojo, azul y verde, que a su vez marcan para distintos componentes del anticuerpo.
Mediante la computadora se fija el "alto" del corte microscópico axial y el "bajo" del mismo (algo así como una TAC pero sumamente pequeña y fina) y se promedian las imágenes de los "scannings", al final las 3 imágenes de los canales se superponen entre si logrando imágenes casi tridimensionales y que muestran el anticuerpo fijado a la célula nerviosa.
Neurona en fase de degeneración vascular, lo que se "pinta" no es la neurona en sí, sino el anticuerpo monoclonal que marca para la proteína TAU.
Vista probable de una degeneración neuronal, conocida como maraña ó "fantasma", perdiendose por completo la morfología, con liberación al espacio extracelular de la proteína y el amiloide.
Placa neutítica, notese la claridad de las acumulaciones extracelulares de neuritas distroficas, células de la microglía activadas y astrocitos reacctivos formando una corona que rodea a un núcleo de polipéptido beta_A4.
Inicialmente se tenía el diagnóstico clínico de enfermedad de Alzheimer en las tres personas, sin embargo, al momento de observar los cortes histológicos en el microscopio se comprobó que el cerebro de una mujer presentaba lesiones difusas de componente amiloideo, que son comunes en el envejecimiento pero estas no eran placas de amiloide BA4 ni presentaban maranas neurofibrilares con los componentes mencionados. Es importante señalar que la técnica de Bielschowsky es el primer paso en el análisis histopatológico, pues demuestra la presencia de placas y marañas, pero no es específico para el amiloide BA4 ni para la proteína tau.
Como en este caso, es frecuente encontrar lesiones parecidas a las marañas en personas con envejecimiento normal sin patologías neuropsiquiátricas agregadas por ejemplo, en la demencia pugilística es posible encontrar lesiones difusas de amiloide BA4 pero en estado no fibrilar. De ahí la diferencia de las pla- cas neuríticas con las "placas seniles" norma- les, pero carentes de componentes neuríticos.
CONCLUSIONES
Aunque se desconocen en conjunto los factores exactos que provocan la EA y su interacción entre si, se sabe que la neuropatogenia involucra diversos factores bioquímicos como hiperfosforilación y una sobreexpresión de la proteína tau, la glucosilación y fenómenos oxidativos junto con otros factores de riesgo como el aluminio. Aunque cada uno de ellos de manera aislada no han probado ser el desencadenante en la génesis de la degeneración neuronal, en conjunto pueden dar una idea y una mayor comprensión de la neuropatología de enfermedad de Alzheimer.
En nuestro estudio logramos el diagnóstico definitivo junto con el clínico en 2 de los casos, y desecharlo en otro, esto desde luego no es un menosprecio a la clínica, sino una muestra de lo difícil que resulta establecer un diagnóstico de presunción entre todo el cúmulo de demencias que afectan a los adultos mayores.
Aunque en el presente se experimenta con diversos tratamientos farmacológicos muy específicos como los inhibidores de la acetilcolinesterasa (la rivastigmina, por ejemplo), no han faltado los charlatanes (vegetarianos, holísticos, esotéricos, homeópatas) quienes propagan "curaciones" por demás disparatadas como el "transplante" de fragmentos de epiplón a las meninges, dietas naturistas y otras mas que carecen no solo de fundamento científico sino de cordura.
Recientemente se han hecho estudios serios sobre una raíz oriental llamada "Gingko Biloba" que aparentemente mejora las condi- ciones de pacientes en estadios iniciales, sin embargo, hasta el momento no hay ninguna evidencia científica que sustente esta teoria.
El autor desea manifestar su profundo agradecimiento al Dr. Raúl Mena López, jefe del laboratorio 2 del Departamento de Fisiología, BiofiSica y Neurociencias del CINVESTAV-IPN por las facili dades y apoyo otorgados en este estudio. Igualmente al Dr. Francisco García por sus observaciones y a todo el personal de dicho laboratorio, especialmente a Lourdes Alarcón y José Luna.
REFERENCIAS
1 New Patterns of Intraneuronal accumulation of the Microtubular Binding domain of tau in granulovacuolar degeneration. Mena R, Robitaille Y, Cuello C. Mc Gill University, Canada 1992.
2 Clinical Diagnosis and Management of Alzheimer's Disease. Gauthier Serge. McGill Centre for Studies on Aging. Canada, 1993
Este Artículo fue publicado en la Revista Médica de la Facultad de Medicina y Cirugía de la UNIVERSIDAD AUTÓNOMA "BENITO JUAREZ" DE OAXACA UABJO.